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LHR真核表达载体构建以及表达

LHR真核表达载体构建以及表达

分类:临床医学论文   更新:2015/3/22   阅读:   作者:佚名   来源:本站原创

LHR真核表达载体构建以及表达

    1  材料与方法
    1.1  材料  MCF7乳腺癌细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。含LHRcDNA的质粒载体由美国Louisville大学Zhenmin Lei教授提供。胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);DMEM培养基、G418、质粒载体pCDNA3.1(+)、pEGFP、脂质体转染试剂LipofectamineTM2000、RNA Trizol(美国Invitrogen公司);限制性核酸内切酶ApaⅠ(美国Promega公司),限制性核酸内切酶KpnⅠ及NheⅠ(美国纽英轮生物技术有限公司);1Kb DNA ladder Marker、小抽质粒抽提试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司);大抽质粒抽提试剂盒Hispeed plasmid midi kit(25)(德国QIAGEN公司);RTPCR试剂(日本TaKaRa公司);cAMP EIA kit(美国Cayman公司);hCG(美国Sigma公司)。引物合成与测序由上海英骏生物技术有限公司完成。
    1.2  方法  参照文献[56]。
    1.2.1  构建pcDNA3.1(+)LHR重组质粒  KpnⅠ/HpaⅠ双酶切LHRcDNA质粒载体、KpnⅠ/EcoR V 双酶切pcDNA3.1(+)载体,琼脂糖电泳分离,胶回收纯化,T4DNA连接酶将pcDNA3.1(+)载体与LHRcDNA片段连接,构建的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)LHR,具体操作步骤按说明书。按常规方法将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,在含氨苄青霉素(100 μg/mL)LB平板挑取单克隆,于2 mL LB培养扩菌,小量快速抽提试剂盒抽提载体质粒。应用酶切图谱分析方法鉴定,选取酶切图谱分析结果鉴定的2个克隆载体DNA送上海英骏生物技术有限公司进行DNA序列测定。pcDNA3.1(+)LHR质粒载体在含100 μg/mL氨苄青霉素的液体LB中大量培养,用Hispeed plasmid midi kit抽提质粒。
    1.2.2  重组质粒转染MCF7细胞  将MCF7细胞按每孔2×105接种于24孔细胞培养板(美国corning公司),24 h后按每孔0.4 μg及1 μg分别将pcDNA3.1(+)LHR重组质粒及空载体质粒以LipofectamineTM2000转染入MCF7细胞,具体操作按试剂说明书。
    1.2.3  筛选转染细胞  转染24 h后,加入400 μg/mL G418筛选转染细胞,每隔2 d换液,直至出现细胞克隆。用胰酶消化,在显微镜下挑取克隆,移至24孔板继续培养,G418筛选,并再次挑取单克隆细胞,大量培养。
    1.2.4  鉴定转染细胞
    1.2.4.1  RTPCR鉴定  根据已发表的LHR基因序列(NM 013582)设计并合成引物。引物序列:
    F:5’ACAGCTGCTGGTGCTGGCAATG3’
    R:5’TCCCTTGGAAAGCGTTCCCTG3’
    RTPCR两步法扩增500 bp LHR目的片段,扩增条件如下:反应经94 ℃预变性5 min后进入循环;94 ℃变性45 s→57.5 ℃退火45 s→72 ℃延伸75 s,扩增32个循环;循环结束后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物,琼脂糖凝胶电泳,观察有无特异目的条带。
    1.2.4.2  cAMP 浓度测定方法鉴定  将稳定转染LHR的MCF7细胞按每孔4×105接种于12孔细胞培养板,24 h后弃旧培养基,用无血清DMEM培养基洗2遍,每孔加入含0,0.16,1.6,16 IU/mL hCG的DMEM培养基0.4 mL, 置于体积分数为0.05的CO2、37 ℃培养箱培养2 h,收集上清液,按操作说明书测定。
    2  结  果
    2.1  重组质粒鉴定  重组质粒pcDNA3.1(+)LHR酶切图谱分析,琼脂糖电泳结果见图1。酶切图谱显示,酶切结果与pcDNA3.1(+)LHR 重组载体酶切位点相符。
    2.2  测序结果  以质粒pcDNA3.1(+)的通用引物BGH、T7为测序引物,测定结果显示pcDNA3.1(+)LHR载体中LHR序列与LHR基因序列完全符合。
    2.3  转染细胞的筛选、鉴定  重组质粒转染MCF7乳腺癌细胞后,经G418筛选,14 d后24孔板上见G418抗性的细胞克隆形成。经2次筛选后转染重组质粒的细胞挑出8个克隆,提取细胞RNA,经ND1000紫外分光光度测定RNA浓度,经RTPCR扩增,发现转染重组质粒后细胞表达LHR,转染空载体细胞不表达目的LHR(图2),选择第8克隆细胞进行实验。LHR属于G蛋白偶联受体超家族成员,对LH与hCG有高亲和性,cAMP作为第二信使,参与其信号转导。本实验通过检测hCG作用后转染LHR及空载体MCF7细胞内cAMP浓度(表1),证实转染LHR的MCF7细胞高表达LHR。
    3  讨  论
    hCG的主要生理功能是刺激卵巢黄体分泌孕酮,维持妊娠,促进乳腺发育。近年来的研究发现hCG具有抑制乳腺癌发生、发展的作用,针对hCG的表1  hCG对乳腺癌细胞cAMP浓度影响
    研究可望能为乳腺癌的防治提供新的思路[79]。hCG在体内的重要生理功能是由LHR介导。但由于LHR在乳腺细胞表达较低,体外hCG对乳腺癌细胞的作用不明显,影响作用机制的深入研究,因此本实验通过建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株,为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用机制提供体外研究的细胞模型。
    笔者成功构建了pcDNA3.1(+)LHR真核表达载体,经LipofectamineTM2000转染,G418筛选,获得高表达LHR的MCF7细胞克隆。LHR在hCG刺激后,激活膜内腺苷酸环化酶,促进ATP转化为cAMP,cAMP进一步激活PKA,cAMP是LHR信号转导途径重要的信息传递分子[5]。hCG作用于稳定表达LHR的MCF7细胞,其cAMP水平明显升高,证实转染后MCF7细胞表达LHR,成功构建高表达LHR的MCF7细胞。这一工作的完成,为进一步研究hCG对乳腺癌的作用及其作用机制提供前提条件。

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