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论鸡蛋白提取液对体外培养干细胞蛋白的影响

分类:生物论文   更新:2016/12/2   来源:网络

  有文献报道动物的卵细胞提取液能重新编程体细胞,包括猪的卵细胞[1]和非洲爪蟾的卵细胞[2,3]提取液都能使体细胞核重编程。在这个研究中,我们用鸡蛋白提取液作用于不同细胞,共培养3d后,收集细胞,送公司做干细胞蛋白芯片检测,现将研究报道如下。

  1材料与方法

  1.1细胞来源

  4种细胞为我们实验室经常培养的细胞,C57小鼠的骨髓间充质干细胞(C57-BMSC)(自己制备),树鼩的脐带间充质干细胞(TS-UC-MSC)(自己制备),293T细胞(购自中国科学院昆明细胞库)和GFP慢病毒转染成功的293T细胞(293T-GFP)(自己转染成功).

  1.2鸡卵清提取液的制备

  取几个鸡卵,无菌分离卵清和卵黄,卵清按1∶1加裂解液,充分搅匀,存放于-20℃。冻融3次后,离心,取上清,4℃保存。裂解液配方:50mmol/LNaCl,5mmol/LMgCl2,100mmol/LHEPES,pH8.2,1mmol/L二硫苏糖醇(DTT),0.1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂。由此得到的提取液为鸡卵清提取液。获得的提取液用50%的终浓度与293T细胞共培养3d,然后用定量PCR的方法检测细胞多能基因OCT4和NANOG与对照(培养基培养)相比明显升高,即为质控指标合格,可用于下面的实验。

  1.3干细胞蛋白芯片检测步骤

  每个芯片孔中加入100μl的1×封闭液,室温摇床上孵育30min,避免产生气泡;抽去封闭液,每个孔中添加100μl样品,一个阵列一个样品;4℃振荡过夜孵育。使用ThermoScientificWellwashVersa芯片洗板机清洗玻片,每孔加入70μl生物素标记抗体;室温震荡孵育1~2h,清洗,每孔加入70μl的1500倍稀释的荧光剂-链霉亲和素,用密封条贴住玻片,然后用铝箔纸包住玻片避光室温震荡孵育1~2h.清洗,采用激光扫描仪例如AxonGenePix扫描信号。采用芯片分析软件提取数据,对于Foldchange,选取大于1.5为有统计学意义。

  1.4Westernblot检测多能标志

  蛋白OCT4和NANOG兔抗人OCT4多克隆抗体购自Immunoa-way公司,鼠抗人NANOG单克隆抗体购自Millipore公司,二抗均购自碧云天生物技术有限公司。293T细胞在6孔板中,一孔加培养基,一孔加50%终浓度的鸡蛋白提取液,共培养3d后,用碧云天的IP细胞裂解液提细胞蛋白,取50μl细胞蛋白液加10μl6×的上样缓冲液,100℃水浴5min,上样20μl,进行SDS-PAGE电泳,电泳结束后,100v电压转膜1h,膜用5%脱脂奶粉的TBS封闭37℃1h,将一抗1∶250稀释于2%脱脂奶粉的TBS中,37℃振摇1h,TTBS洗3次,每次5min,二抗1∶200稀释于2%脱脂奶粉的TBS中,37℃振摇1h,TTBS洗3次,每次5min,ECL显色,用Tanon的化学发光成像仪检测发光条带。

  2结果

  2.1C57-BMSC有3个蛋白发生了统计学意义的改变SOX17、BMPR-1A和NANOG是干细胞中表达的蛋白,当体细胞向干细胞转变后细胞中这几个蛋白的表达升高,我们用50%终浓度的鸡蛋白提取液与C57-BMSC共培养3d后,这几个蛋白的表达明显升高,说明C57-BMSC又向更多能的干细胞分化了,见图1.

  2.2TS-UC-MSC有1个蛋白发生了统计学意义的改变BMPR-1A是干细胞多能性的标志,TS-UC-MSC用50%鸡蛋白提取液共培养3d后,与未加鸡蛋白提取液培养的细胞相比,BMPR-1A明显升高,说明细胞又向多能干细胞的方向分化了,见图2.

  2.3293T有1个蛋白发生了统计学意义的改变BMPR-1A是干细胞多能性的标志,293T细胞是标准的体细胞株,用50%鸡蛋白提取液共培养3d后,BMPR-1A表达明显升高,说明293T细胞有向干细胞转变的现象发生,见图3.

  2.4293T-GFP有1个蛋白发生了统计学意义的改变OCT4是干细胞多能性的标志,293T-GFP用50%的鸡蛋白提取液共培养后,对比培养基培养的细胞OCT4的表达明显

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